Examen enzimas

Cálculo de la actividad enzimática

En los ensayos que muestran ráfagas o fases de retardo, es importante determinar la causa para saber qué fase de la reacción corresponde a la verdadera “tasa inicial” de la reacción. El término “tasa inicial” se utiliza normalmente para referirse a la tasa en estado estacionario de la reacción que se establece después de que se haya producido cualquier evento previo al estado estacionario.

La alternativa a un ensayo detenido es un ensayo continuo en el que se sigue el progreso de la reacción a medida que se produce. Los ensayos continuos son mucho más convenientes porque el resultado se ve inmediatamente y se puede observar cualquier desviación de la tasa inicial respecto a la linealidad. Por otro lado, no todas las enzimas tienen un método de ensayo que pueda observarse de forma continua. El ensayo continuo más sencillo es aquel en el que la acción de la propia enzima puede seguirse por medio de cambios en la absorbancia (por ejemplo, NAD(P)H a 340 nm con deshidrogenasas), fluorescencia, viscosidad, pH o alguno de los otros parámetros físicos posibles. En muchos ejemplos de ensayos de hidrolasas, se utiliza un sustrato artificial que libera un producto coloreado o fluorescente. Pero la mayoría de las enzimas no producen ningún cambio en un parámetro físico fácilmente detectable por su actividad. Esto puede superarse utilizando un método continuo acoplado. En este proceso, se sigue actuando sobre el producto (normalmente mediante otras enzimas que se añaden a la mezcla), hasta que se forma un producto final que puede observarse físicamente. Una gran ventaja de los ensayos acoplados es que el producto se elimina, lo que ayuda a mantener constante la tasa medida durante un largo periodo al evitar la inhibición del producto y la inversión de la reacción. referencia

Actividad enzimática

La unidad del SI es el katal, 1 katal = 1 mol s-1 (mol por segundo), pero es una unidad excesivamente grande. Un valor más práctico y comúnmente utilizado es la unidad enzimática (U) = 1 μmol min-1 (micromol por segundo). 1 U corresponde a 16,67 nanokatales[1].

La actividad enzimática, expresada en katal, se refiere generalmente a la del supuesto sustrato natural objetivo de la enzima. La actividad enzimática también puede darse como la de ciertos sustratos estandarizados, como la gelatina, que se mide en unidades de digestión de la gelatina (GDU), o las proteínas de la leche, que se miden en unidades de coagulación de la leche (MCU). Las unidades GDU y MCU se basan en la rapidez con la que un gramo de la enzima digiere la gelatina o las proteínas de la leche, respectivamente. 1 GDU equivale aproximadamente a 1,5 MCU[2].

Una mayor cantidad de sustrato aumentará la velocidad de reacción de las enzimas, sin embargo, una vez pasado cierto punto, la velocidad de reacción se nivelará porque la cantidad de sitios activos disponibles ha permanecido constante.

La actividad específica de una enzima es otra unidad común. Es la actividad de una enzima por miligramo de proteína total (expresada en μmol min-1 mg-1). La actividad específica da una medida de la pureza de la enzima en la mezcla. Se trata de los micromoles de producto formados por una enzima en un tiempo determinado (minutos) en unas condiciones dadas por miligramo de proteínas totales. La actividad específica es igual a la velocidad de reacción multiplicada por el volumen de reacción dividido por la masa de proteínas totales. La unidad del SI es katal/kg, pero una unidad más práctica es μmol/mgmin.

Experimento enzimático

Las quinasas y las ATPasas desempeñan funciones biológicas esenciales en el metabolismo y la regulación. La actividad de estas enzimas se suele medir acoplando el consumo de ATP a la síntesis de un producto detectable. En la mayoría de los sistemas de ensayo se desconoce la concentración de ATP durante la reacción, lo que compromete la precisión del ensayo. Utilizando la hexocinasa específica de ADP (ADP-HK) de la arquea termófila Thermococcus litoralis, el protocolo que aquí se describe permite acoplar en tiempo real el consumo de ATP al cambio de señal aguas abajo, lo que permite realizar mediciones cinéticas precisas. El ADP-HK fosforila la glucosa, que luego es utilizada por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa para reducir el NAD+ a NADH, que puede medirse a 340 nm. Hemos demostrado que este ensayo es sensible a la detección de cantidades de micromoléculas de ADP sin un fondo detectable de ATP.

El protocolo descrito aquí demuestra cómo la especificidad de la ADP-hexocinasa de T. litoralis puede utilizarse en una reacción enzimática acoplada para medir las actividades de la ATPasa o la cinasa. Los materiales y el equipo necesarios para este ensayo son comúnmente accesibles, lo que permite obtener mediciones sensibles sin tener que comprar costosos kits comerciales. El ensayo produce una conversión rápida y estequiométrica de ADP en una señal de absorbancia que puede medirse continuamente y la alta especificidad y sensibilidad asegura un bajo fondo y, por tanto, mediciones cinéticas precisas.

Revisión de las enzimas

Nuestras décadas de experiencia en el diseño y la fabricación de enzimas activas y sus sustratos respaldan el desarrollo de una cartera de ensayos bioquímicos en constante expansión. Nuestro menú de ensayos de actividad enzimática escalables está anclado en nuestra plataforma de ensayos de desacetilasas FLUOR DE LYS®, que incluye kits para el cribado de moduladores de la actividad de HDAC y Sirtuina. También ofrecemos ensayos basados en FRET para las metaloproteinasas de la matriz (MMP) y la actividad de las caspasas, así como ensayos de cinasas basados en anticuerpos fosfoespecíficos. Estos ensayos ejemplifican la sinergia de las capacidades de Enzo, reuniendo péptidos pequeños, síntesis de proteínas recombinantes activas, tecnologías de etiquetado y detección fluorescente y desarrollo de anticuerpos en kits de ensayo robustos y reproducibles.

Durante más de una década, la plataforma de ensayo FLUOR DE LYS® deacetilasa ha revolucionado el ensayo de la actividad de las enzimas HDAC y Sirtuina, liberando a los investigadores de los engorrosos protocolos requeridos con los métodos basados en histonas radiomarcadas o modificadas. Nuestros ensayos de alta calidad utilizan una química patentada de sustrato/desarrollo en combinación con enzimas de alta actividad y alta pureza, para ofrecer más resultados de alta calidad. Los ensayos de cribado de HDAC/Sirtuina de amplia clase están disponibles en formatos quimioluminiscentes, fluorescentes y colorimétricos.